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ELISA實驗操作要點:ELISA檢測需做好那幾步

更新時間:2023-12-11    點擊次數(shù):953

  ELISA實驗操作要點:ELISA檢測需做好那幾步


  ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中最為廣泛最為靈敏的技術(shù)手段。可是在新老手操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題,比如說花板,假陽性,全顯色,全部顯色,顯色比空白還低.。

  1、包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,是否降解,這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保存抗原很重要,我做重組蛋白時,師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白,對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被,方法簡要的列出如下:

  ①親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

  ②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。

  ③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

  2、包被液的選擇,一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理:由于蛋白質(zhì)與聚苯乙/烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用,這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐,看一下最終可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

  3、封閉:繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉,可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但最終選用什么,要依據(jù)試驗具體來實踐。

  4、洗滌板:可以說在ELISA操作中,洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙/烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,清除殘留在板孔中游離的物質(zhì),以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì),在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差,人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機除外),洗的不或串了孔,對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。

  5、加抗體標(biāo)本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用PBS稀釋,也可用封閉液去稀釋。如需加二抗,還要注意二抗的工作濃度,太高浪費,太低則著色淺。

  6、顯色:顯色系統(tǒng)又很多,我們一開始做的時候,要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵,AP結(jié)合物可加疊氮鈉。

  7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好,如出現(xiàn)問題也好分析。

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